การศึกษายีนต้านทานโรคในยางพาราเพื่อการปรับปรุงพันธุ์ยาง

[doa]

การศึกษายีนต้านทานโรคในยางพาราเพื่อการปรับปรุงพันธุ์ยาง
ชัชมณฑ์ แดงกนิษฐ์ นาถาวร และอารมณ์  โรจน์สุจิตร์
ศูนย์วิจัยยางสุราษฎร์ธานี  สถาบันวิจัยยาง และสำนักวิจัยและพัฒนาการเกษตรเขตที่ 7  

          Phytophthora palmivora เป็นเชื้อสาเหตุที่ก่อให้เกิดโรคใบร่วงและโรคเส้นดำในยางพารา ทำให้ใบร่วงก่อนเวลาอันควร และหน้ากรีดของต้นยางเสียหายมีผลให้ผลผลิตลดลง ผู้วิจัยได้ทำการศึกษาการแสดงออกของยีนในยางพาราพันธุ์ BPM 24 ซึ่งเป็นพันธุ์ต้านทาน และ RRIM 600 ซึ่งเป็นพันธุ์อ่อนแอ ที่ได้รับการกระตุ้นให้เกิดโรคจากการพ่นใบยางด้วยซูโอสปอร์ (zoospore) ของเชื้อ P. palmivora เปรียบเทียบกับชุดควบคุม (พ่นด้วยน้ำกลั่นนึ่งฆ่าเชื้อ) โดยใช้เทคนิคซีดีเอ็นเอ-เอเอฟแอลพี (cDNA-AFLP) ซึ่งเป็นเทคนิคที่สามารถแสดงความแตกต่างของยีนที่มีการแสดงออกแตกต่างกัน โดยดูจากแถบดีเอ็นเอท่อนสั้นๆ ที่ปรากฏหลังจากแยกด้วยกระแสไฟฟ้าบนแผ่นเจล

          การทำซีดีเอ็นเอ-เอเอฟแอลพี เริ่มจากสกัดอาร์เอ็นเอรวม (total RNA) จากใบยางจากนั้นแยก mRNA เพื่อเตรียมเป็น cDNA แล้วจึงตัดย่อย cDNA ด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะจะได้ cDNA ท่อนสั้นๆ จำนวนมากเชื่อมต่อ cDNA เหล่านี้ด้วย adapter เพื่อให้เป็นส่วนที่จะจับกับ selective primer ที่แตกต่างกัน แล้วนำส่วนผสมทั้งหมดไปแยกบน 6% denaturing polyacrylamide gel ด้วยกระแสไฟฟ้าคงที่ที่ 350 โวลท์ อุณหภูมิ 14 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 12-14 ชั่วโมง ผลการทดลอง เมื่อเปรียบเทียบระหว่างใบยางที่ได้รับเชื้อ (zoospore) กับชุดควบคุม (ปลอดเชื้อ) พบว่า การแสดงออกของยีนส่วนใหญ่ทั้งในพันธุ์ BPM 24 และ RRIM 600 มียีนที่มีการแสดงออกมากขึ้น (up regulation) หลังจากได้รับเชื้อ ซึ่งในเบื้องต้นคาดว่าน่าจะเกี่ยวข้องกับความต้านทานต่อเชื้อ P. palmivora หรือเรียกว่าเป็น candidate gene จึงได้คัดเลือกยีนในกลุ่มดังกล่าวจากพันธุ์ BPM 24 มาหาลำดับเบสของยีน แล้วนำไปสืบค้น (Blast search) กับยีนที่มีรายงานอยู่ใน GenBank and Protein Database (NCBI) พบว่าส่วนใหญ่เป็นยีนที่เกี่ยวข้องกับ defense mechanism ในเซลล์พืชได้แก่ ยีนที่ควบคุมการสร้างเอ็นไซม์ peroxidase และ phenylalanene amonia lyase และยีนที่ควบคุมการสร้างโปรตีนในกลุ่ม pathogenesis related-protein คือ ß-1,3 –glucanase และ chitinase และในการทดลองนี้ได้พบยีนที่ยังไม่มีรายงานในฐานข้อมูลนั่นคือ อาจเป็นยีนที่ค้นพบใหม่ 

         นอกจากนี้จากการใช้เทคนิค semi-quantitative RT-PCR (sqRT-PCR) พบว่า ระยะเวลาของการได้รับเชื้อในพันธุ์ BPM 24 ซึ่งเป็นพันธุ์ต้านทาน มีความสัมพันธ์กับกับการแสดงออกของ peroxidase mRNAโดยมีการแสดงออกของ peroxidase mRNA สูงสุดภายหลังจากได้รับเชื้อ 18 ชั่วโมง ดังนั้น peroxidase mRNA จึงอาจเป็นยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้าง scopolitin (phytoalexin) ซึ่งเป็นสารที่ใบยางสร้างขึ้นเพื่อต่อต้านการรุกรานของเชื้อ (Churngchow and Rattarasarn, 2001) จึงควรจะได้ทดสอบการแสดงออกของยีนเหล่านี้กับปริมาณการสร้าง scopolitin เพื่อจะได้ทราบว่ามีความสัมพันธ์กับระดับความต้านทานต่อเชื้อหรือไม่ต่อไป