การผลิตแอนติซีรัมของเชื้อสาเหตุโรคกรีนนิ่งส้มโดยใช้ระบบเซลล์แบคทีเรีย

[doa]

การผลิตแอนติซีรัมของเชื้อสาเหตุโรคกรีนนิ่งส้มโดยใช้ระบบเซลล์แบคทีเรีย
วันเพ็ญ ศรีทองชัย, ศรีเมฆ ชาวโพงพาง และดารุณี ปุญญพิทักษ์
กลุ่มวิจัยโรคพืช สำนักวิจัยพัฒนาการอารักขาพืช

          แยกสกัดดีเอ็นเอจากเส้นกลางใบของแพงพวยที่เป็นโรคกรีนนิ่งโดยใช้ CTAB buffer แล้วนำไปเพิ่มปริมาณของชิ้นดีเอ็นเอด้วยเทคนิค PCR ใช้ไพรเมอร์จากส่วนของยีน outer membrane protein ของเชื้อสาเหตุโรคกรีนนิ่งส้ม ได้แก่ OMP1 Stu และ OMP2 Stu สังเคราะห์ได้ชิ้นของดีเอ็นเอขนาด 996 คู่เบส จากนั้นนำไปโคลนเข้าสู่ cloning vector (pTrcHis2-TOPO) และคัดเลือกเฉพาะโคลนที่มีชิ้นดีเอ็นเอที่เชื่อมเข้าไปใน vector นำมาทำให้บริสุทธิ์ แล้วตรวจสอบลำดับเบสพบว่า มีขนาด 996 คู่เบส จากนั้น subclone ยีน omp ขนาด 996 คู่เบส เข้าสู่ expression vector pET160/GW/D-TOPO® (Invitrogen) และ transform เข้า E. coli Top 10 พบว่า มีลำดับนิวคลีโอไทด์ 1128 คู่เบส ซึ่งประกอบด้วยยีน omp ขนาด 996 คู่เบส + Lumio tag 132 คู่เบส คัดเลือกโคลนที่สามารถสังเคราะห์โปรตีนได้ในเซลล์ของ E. coli BL 21 (DES 3) ในอาหาร 2XYT ที่เติมสารปฏิชีวนะ ampicillin 100 มิลลิกรัม/ลิตร และใช้สาร Isopropyl-β-D thiogalactopyranoside (IPTG) ในการชักนำให้เกิดการสังเคราะห์โปรตีนพบว่า ระยะเวลาที่สามารถสังเคราะห์โปรตีนได้สูงสุด คือ 24 ชั่วโมง โดยให้โปรตีนที่มีขนาดประมาณ 41 กิโลดาลตัน จากนั้นนำไปผ่าน Ni-NTA column แล้วนำโปรตีน 1 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร ไปฉีดเข้าใต้ผิวหนังบริเวณคอของกระต่ายโดยผสมกับ Freund’s adjuvant ทุก 2 สัปดาห์ รวม 5-6 ครั้ง และเจาะเลือด 6 ครั้ง ผลการตรวจสอบคุณภาพของแอนติซีรัมที่ได้ด้วยวิธี indirect ELISA โดยเจือจางตั้งแต่ 1 : 10 ถึง 1 : 1,000,000 พบว่า แอนติซีรัมจากการเจาะเลือดครั้งที่ 4-6 มีประสิทธิภาพสูงสุดสามารถทำปฏิกิริยาได้จนถึง 1 : 100,000 จากนั้นทำการทดสอบประสิทธิภาพของแอนติซีรัมกับตัวอย่างพืชตระกูลส้ม โดยเปรียบเทียบชนิดของ plate พบว่า microwell plate ของ Nunc ให้ปฏิกิริยาดีที่สุด และอัตราใบพืช : coating buffer 1 : 5 และความเข้มข้นของแอนติซีรัม 1 : 500 ให้ผลได้ดี สามารถนำไปปรับใช้ตรวจโรคกรีนนิ่งของพืชตระกูลส้มต่อไปได้