การโคลนยีน EPSPS และผลิตแอนติบอดีในระบบเซลล์แบคทีเรีย เพื่อผลิตชุดตรวจสอบถั่วเหลือง

[doa]

การโคลนยีน EPSPS และผลิตแอนติบอดีในระบบเซลล์แบคทีเรีย เพื่อผลิตชุดตรวจสอบถั่วเหลืองดัดแปรพันธุกรรม (Roundup Ready)
ขนิษฐา วงศ์วัฒนารัตน์, ศรีเมฆ ชาวโพงพาง, ประเสริฐ วงศ์วัฒนารัตน์, วันเพ็ญ ศรีทองชัย, สุรภี กีระติยะอังกูร, กิ่งกาญจน์ พิชญกุล และอลงกรณ์ กรณ์ทอง
สำนักวิจัยเทคโนโลยีชีวภาพ, คณะเกษตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์, คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยธรรมศาสตร์ (ศูนย์รังสิต), สำนักวิจัยพัฒนาการอารักขาพืช และสำนักผู้เชี่ยวชาญ กรมวิชาการเกษตร

          งานวิจัยการโคลนยีน EPSPS และผลิตแอนติบอดีในระบบเซลล์แบคทีเรีย เพื่อผลิตชุดตรวจสอบถั่วเหลืองดัดแปรพันธุกรรมต้านทานสารกำจัดวัชพืชไกลดฟเสท (Roundup Ready) เริ่มจาการเพิ่มปริมาณยีน EPSPS จากดีเอ็นเอของถั่วเหลืองดัดแปรพันธุกรรมต้านทานสารกำจัดวัชพืชไกลโฟเสทด้วยคู่ primers จำเพาะ EPSPS 1 และ EPSPS 2 ได้ชิ้นดีเอ็นเอขนาด 1,368 bp แปลเป็นลำดับกรดอะมิโนพบว่า มีความยาว 455 กรดอะมิโน เมื่อนำชิ้นดีเอ็นเอ EPSPS เชื่อมต่อเข้าไปยัง Expression vector (pET200 TOPO) แล้วถ่ายฝากเข้าไปในเซลล์แบคทีเรีย escherichia coli BL21 นำมาเลี้ยงเพิ่มปริมาณในอาหารเหลว 2xYT ที่มีกานามัยซินผสมอยู่ชักนำให้สร้างโปรตีนด้วยการเติมสาร IPTG เข้มข้น 1 mM ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 0, 2, 4, 6, 12, 18, 24 และ 36 ชั่วโมง พบว่าระยะเวลา 24 ชั่วโมง เป็นเวลาที่มีการเพิ่มปริมาณโปรตีนสูงสุด แล้วนำมาแยกสกัดโปรตีนให้บริสุทธิ์ด้วย column Ni-NTP Superflow ผลการตรวจหาความเข้มข้นโปรตีนที่แยกได้ด้วยเทคนิค SDS-PAGE พบว่ามีขนาดของโปรตีนประมาณ 52 กิโลดาลตัน นำโปรตีนบริสุทธิ์ไปใช้ในเป็นแอนติเจนในการผลิต Polyclonal antibody ในกระต่าย แล้วสกัด IgG ให้บริสุทธิ์ พบว่าความเข้มข้นที่เหมาะสมของ IgG ในการตรวจโปรตีน EPSPS และถั่วเหลืองดัดแปรพันธุกรรม Roundup Ready ด้วยวิธี Dot immunoblinding assay (DIBA) คือ 2 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร และ IgG ที่ผลิตได้สามารถตรวจโปรตีน EPSPS ได้ปริมาณต่ำสุด 1 นาโนกรัม/มิลลิลิตร หลังจากนั้นนำ IgG มาประกอบเป็นชุดตรวจสอบแบบ Gold Lateral Immuno Flow Test (GLIFT kit) สามารถตรวจสารละลายโปรตีน EPSPS ความเข้มข้น 100 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร จะเกิดปฏิกิริยาสีม่วง 2 แถบ คือ Test line และ Control line ในขณะที่สารละลายที่ไม่มีโปรตีน EPSPS เกิดปฏิกิริยาสีม่วงแถบเดียวคือ Control line โดยปฏิกิริยาเกิดขึ้นภายใน 5 นาที หลังจากนั้นนำมาตรวจตัวอย่างเมล็ดถั่วเหลืองบดละเอียดที่มีการปนเปื้อนถั่วเหลืองดัดแปรพันธุกรรม Roundup Ready พบว่าเกิดปฏิกิริยาภายใน 5 นาที เช่นเดียวกัน