การใช้เทคโนโลยีชีวภาพเพื่อพัฒนาพันธุ์พืช จุลินทรีย์ และผลิตภัณฑ์

[doa]

การใช้เทคโนโลยีชีวภาพเพื่อพัฒนาพันธุ์พืช จุลินทรีย์ และผลิตภัณฑ์
รุ่งนภา พิทักษ์ตันสกุล

          การใช้เทคโนโลยีชีวภาพเพื่อพัฒนาพันธุ์พืช จุลินทรีย์ และผลิตภัณฑ์ เป็นโครงการที่เริ่มดำเนินการตั้งแต่ปี 2554 - 2558 โดยมีวัตถุประสงค์เพื่อรวบรวม พัฒนา และค้นหาสารสำคัญของจุลินทรีย์เพื่อไปใช้ประโยชน์ทางการเกษตร ได้แก่ แบคทีเรีย รา ยีสต์ และสาหร่ายขนาดเล็ก นอกจากนี้ค้นหาสารยับยั้งการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์สาเหตุโรคพืช และจุลินทรีย์ที่ส่งเสริมการเจริญเติบโตต่อพืช เพื่อการถ่ายยีนและการแสดงออกของยีน dihydroflavonol 4-reductase (DFR) ในรูป antisense เพื่อสร้างความหลากหลายของสีดอกหน้าวัว เพื่อค้นหาตำแหน่งการเกิดเครื่องหมายดีเอ็นเอ SNP ในจีโนมยางพารา และใช้เครื่องหมายโมเลกุลเพื่อให้ได้ข้อมูลที่สามารถระบุความใกล้ชิดทางพันธุกรรม สำหรับใช้ประกอบการคัดเลือกพ่อแม่พันธุ์ที่เหมาะสมในการปรับปรุงพันธุ์ข้าวโพดข้าวเหนียว และเพื่อศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมและความสัมพันธ์ที่ได้จากการทำลายพิมพ์ดีเอ็นเอเห็ด องุ่น และกล้วยไม้รองเท้านารีในประเทศไทย ซึ่งเป็นจุลินทรีย์และพืชที่นำมาศึกษาที่มีความสำคัญทางเศรษฐกิจของประเทศไทย วิธีการศึกษาโดยใช้เทคโนโลยีชีวภาพเข้ามาช่วยปรับปรุงและพัฒนาให้ได้สายพันธุ์ใหม่ ซึ่งเทคนิคทางชีวโมเลกุลที่นำมาใช้ได้แก่ การจำแนกชนิดของเชื้อจุลินทรีย์ ได้แก่ แบคทีเรีย เชื้อรา และสาหร่ายขนาดเล็ก โดยวิเคราะห์ความแตกต่างทางพันธุกรรมในส่วนของ rDNA sequence การโคลนยีนที่เกี่ยวข้องกับเอนไซม์เซลลูโลส ไซแลน ไลเปส waxy gene เข้าสู่เวคเตอร์ และศึกษาการแสดงออกของยีนที่ถ่ายเข้าสู่แบคทีเรีย ยีสต์ สาหร่าย และยีน dihydroflavonol 4-reductase (DFR) ในรูป antisense ในดอกหน้าวัว นอกจากนี้การปรับปรุงพันธุ์ยางพาราโดยใช้เครื่องหมายดีเอ็นเอ SNP และการประเมินลักษณะทางพันธุกรรมข้าวโพด องุ่นและกล้วยไม้รองเท้านารี โดยใช้เครื่องหมายโมเลกุล SSR หรือ Microsatellite และจัดกลุ่มเพื่อแยกความแตกต่างของแต่ละสายพันธุ์ เพื่อนำไปใช้ปรับปรุงพันธุ์ต่อไป ซึ่งผลการทดลองพบว่า สามารถโคลนยีนที่เกี่ยวข้องกับการย่อยสลายชีวมวลจำนวน 3 ยีน ได้แก่ endo glucanase, cellobiohydrolase และ beta-D-glucosidase ใส่ในเวคเตอร์ pPICZA pPICZB และ pPICZC ซึ่งเป็นเวคเตอร์ที่มีคุณสมบัติเหมาะสมในการถ่ายลงเซลล์แบคทีเรีย ได้แก่ E .coli และยีสต์ Pichia pastoris นำยีสต์ที่มียีนนั้นไปเลี้ยงเพิ่มปริมาณในอาหาร YPD + Zeocin และเลี้ยงกระตุ้นการแสดงออกของยีนในอาหาร MGYH และกระตุ้นโดยการเติมเมทานอลพบว่า ยีสต์ที่ได้สามารถผลิตโปรตีนได้มีขนาด 45, 25 และ 15 กิโลดาลตัน ตามลำดับ สามารถถ่ายฝากยีนไลเปส 4 ยีน ได้แก่ lip ของ P. aeruginosa, lip A ของ S. marcescens, lip A ของ B. subtilis และ alkaline lip ของ B. cepacia เข้าใน pET TOPO เวคเตอร์และเหนี่ยวนำให้มีการแสดงออกของยีนใน BL21 ได้ไลเปสของ B. subtilis มีประสิทธิภาพในการย่อยน้ำมันปาล์มอย่างสมบูรณ์ น้ำมันที่ได้ใสสะอาด เมื่อนำไปผลิตไบโอดีเซลได้ไบโอดีเซล B100 สามารถโคลนยีนและถ่ายฝากยีนไคติเนสของแบคทีเรียเข้าใน pET 100/D-TOPO vector ได้ 6 ยีน และโคลนยีนราได้ 1 ยีน และพบว่ามีประสิทธิภาพในการยับยั้งการเจริญของราโรคพืช 3 เชื้อ ได้แก่ Botryodiplodia theobromae, Pyricularia oryzae และ Fusarium oxysporum และสามารถยับยั้งการงอกของสปอร์ราโรคพืชได้อย่างสมบูรณ์ การทดสอบประสิทธิภาพของเชื้อเห็ด 6 ชนิด 10 ตัวอย่าง ทดสอบด้วยวิธี Dual cultures พบว่าเห็ดแต่ละชนิดมีประสิทธิภาพในการยับยั้งการเจริญของเชื้อราโรคพืชในแต่ละชนิดที่แตกต่างกัน นอกจากนี้ จำแนกชนิดสาหร่ายขนาดเล็กโดยใช้เทคนิคทางชีวโมเลกุลในส่วนของ rDNA โดยใช้ไพรเมอร์ 11 คู่ พบว่าสาหร่าย Chlorella pyrenoidosa (ADOA4) มีการเจริญเติบโตได้รวดเร็วที่สุด ที่ pH 7 - 8 สามารถขยายและเลี้ยงในสภาพกลางแจ้งได้ในอ่างพลาสติกขนาด 600 ลิตร เก็บเกี่ยวเซลล์ได้ในวันที่ 4 - 8 ได้น้ำหนักเฉลี่ย 1.65 กก.น้ำหนักแห้ง/ลบ.ม. และสามารถคัดเลือกสาหร่ายขนาดเล็กที่มีปริมาณแป้งสูงจากการโคลนยีน waxy (Wx gene) เข้าสู่ pChlamy_3 vector และถ่ายยีนเข้าสู่เซลล์สาหร่าย Chlamydomonas reinhardtii ได้จึงเป็นชนิดที่เหมาะสมในการคัดเลือกไปเพิ่มปริมาณและศึกษาเทคโนโลยีการผลิตเป็นไบโอเอทานอลต่อไป สามารถรวบรวมและคัดเลือกเชื้อแบคทีเรียที่มีประสิทธิภาพในการผลิตเอนไซม์เซลลูเลสและไซลาเนสบนอาหาร screening medium ซึ่งมี CMC-Na และ Xylan เป็นองค์ประกอบ จำนวนทั้งสิ้น 488 ไอโซเลท เชื้อแบคทีเรียที่สามารถย่อยเซลลูโลสได้ดี คือ ไอโซเลท AC-10 ให้ค่า reducing sugar สูงที่สุด เท่ากับ 1,350 ug/ml ส่วนเชื้อแบคทีเรียที่มีประสิทธิภาพในการย่อยสลายเฮมิเซลลูโลสได้ดี คือ ไอโซเลท PV4-15x ให้ค่า reducing sugar สูงที่สุด เท่ากับ 3,360 ug/ml จำแนกชนิดแบคทีเรียโดยวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ มีความคล้ายคลึงกับเชื้อ Streptomyces sp. และ Bacillus amyloliquefaciens การโคลนยีนไซลาเนส (endo-1,4-beta-xylanase gene) ทำการเชื่อมต่อชิ้นยีนไซลาเนสเข้ากับ Expression Vector (aLICator LIC Cloning and Expression system) แล้วถ่ายฝากพลาสมิดดีเอ็นเอสายผสมของยีนไซลาเนส เข้าสู่เซลล์ E. coli สายพันธุ์ BL21 (DE3) พบว่า รีคอมบิแนนท์เอนไซม์มีกิจกรรมที่ดีเมื่อเทียบกับชุดควบคุม E. coli BL21 (DE3) ที่ไม่ได้รับการถ่ายยีน สำหรับการศึกษาเอนไซม์เซลลูเลส ได้เก็บรวบรวมเชื้อราทั้งหมด 32 สายพันธุ์ นำมาทดสอบความสามารถในการย่อยสลายเฮมิเซลลูเลสพบว่า มี 10 สายพันธุ์ที่สามารถย่อยสลายเฮมิเซลลูโลสได้ดีบนอาหารทั้ง 4 ชนิด ได้แก่ CMC เปลือกข้าวโพด เปลือกมัน และอากาเว่ ด้านการโคลนยีน เมื่อมีการเลี้ยง E. coli BL21 (DES 3) ที่พลาสมิดสายผสม pET160/GW/D-TOPO มียีน B-D–xylosidase ได้แก่ XldC1, Xld2C1 และ XldC4 ที่กระตุ้นให้มีการแสดงออกของโปรตีนที่ 4 ชั่วโมง ในอาหารเลี้ยงเชื้อแบบเติมและแบบไม่เติม IPTG พบว่ามีการย่อยบนอาหารไซเลน ข้าวโพด และอากาเว่ได้ดี ในขณะที่มีการย่อยได้น้อยมากบนอาหารที่ผสมเปลือกมัน และไม่เกิดการย่อยบนอาหาร CMC เลย ซึ่งผลจากการเลี้ยงเชื้อ แบบเติมและแบบไม่เติม IPTG พบว่า ให้ผลการย่อยเคลียร์โซนบนอาหารที่มีส่วนผสมของไซเลน อากาเว่ และข้าวโพดที่ไม่แตกต่างกัน ในเรื่องของกระบวนการหมักไบโอเอทานอล สามารคัดเลือกยีสต์ที่ได้รับการถ่ายยีน yap1  ซึ่งเป็นยีนที่มีส่วนสำคัญในการกำจัดสารพิษของยีสต์เข้าสู่จีโนมของยีสต์และได้ยีสต์ดัดแปลงพันธุกรรมที่มีอัตตราการเจริญเติบโตสูงและเร็วกว่ายีสต์ WT นอกจากนี้ยีสต์ดัดแปลงพันธุกรรมที่ได้สามารถทนทานต่อสารปฏิชีวนะ Cycloheximide และทนทานต่อสารมีพิษ HMF และสร้างชุดการสังเคราะห์ Over expression vector สำหรับ Cellulase Enzymes พร้อมใช้เพื่อถ่ายเข้าสู่ยีสต์ในการนำไปใช้ย่อยสลายวัสดุเหลือใช้ทางการเกษตรได้ นอกจากนี้ได้คัดเลือกและเก็บรักษาแบคทีเรียทนเย็นได้ 5 สกุล สามารถโคลนยีนแบคทีเรียได้ 3 ยีน คือ Neub family protein with antifreeze-like domains จาก Bacillus cereus ขนาด 984 nucleotides และ antifreeze glycopeptide AFGP related protein จาก Xanthomonas campestris pv. Campestris ขนาด 1887 nucleotides และ afpIII จากปลาน้ำลึก Macrozoarces americanus clone15typeIII 1 ยีน ขนาด 267 nucleotides และ X. campestris ขนาด 8, 30.4 และ 58.3 KDa ตามลำดับ โปรตีนต้านการเกิดผลึกน้ำแข็งที่ผลิตได้จากการทดลองนี้ สามารถลดความเสียหายเนื่องจากการแช่แข็งได้อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ สำหรับเชื้อราเขียวที่ป้องกันแมลง สามารถจำแนกเชื้อราเขียวที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้มีทั้งหมด 14 ตัวอย่าง ซึ่งจากการจำแนกเบื้องต้นพบว่าเป็น Metarhizium anisopliae 11 ตัวอย่าง M. flavoride 1 ตัวอย่าง และ Metarhizium spp. 2 ตัวอย่าง สามารถจำแนกและวิเคราะห์ข้อมูลเห็ดเรืองแสงโดยวิธีหาลำดับเบสบริเวณ ITS ของเห็ดเรืองแสง 4 ชนิด พบว่าเป็นชนิด Mycena chlorophos และ Neonothopanus nimbi อีก 2 ชนิดสามารถจำแนกได้เพียง genus คือ Favolaschia spp. และ Mycena spp. สามารถนำไปถ่ายฝากสู่หน้าวัวพันธุ์โซเนตและพันธุ์ราปิโด จากการคัดเลือกต้นหน้าวัวที่ได้รับการถ่ายยีนในอาหารที่เติม hygromycin และนำไปตรวจสอบด้วยเทคนิค PCR โดยใช้ไพรเมอร์ที่จำเพาะ พบว่าการถ่ายฝากยีน DFRAS เข้าสู่หน้าวัวประสบผลสำเร็จ ได้ทำการค้นหาตำแหน่งการเปลี่ยนแปลงลำดับเบสแบบสนิปของยีนในยางพารา 12 พันธุ์ เพิ่มปริมาณชิ้นดีเอ็นเอของยีน 9 ยีน นำไปวิเคราะห์ลำดับเบส พบว่ามีการเปลี่ยนแปลงเบสแบบสนิปรวม 90 ตำแหน่ง สามารถวิเคราะห์การจัดกลุ่มความเชื่อมโยงได้ทั้งหมด 18 กลุ่ม ซึ่งตรงกับจำนวนชุดจีโนมของยางพารา การเปลี่ยนแปลงลำดับเบสแบบสนิปที่พบจัดเป็นเครื่องหมายดีเอ็นเอที่สามารถนำไปประยุกต์ใช้กับการปรับปรุงพันธุ์ยางพารา และนำไปใช้สร้างลายพิมพ์ดีเอ็นเอเพื่อระบุความเป็นเอกลักษณะของยางพาราแต่ละพันธุ์ได้ การใช้เครื่องหมายโมเลกุลไมโครแซทเทลไลท์เพื่อประเมินความหลากหลายทางพันธุกรรมในระดับ ดีเอ็นเอของข้าวโพดข้าวเหนียว 186 สายพันธุ์ ทำให้การจัดแบ่งกลุ่มความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมได้เป็น 5 กลุ่ม ความแตกต่างทางพันธุกรรมของข้าวโพดด้วยผลของการใช้เครื่องหมายโมเลกุล SSR จึงเป็นประโยชน์สำหรับการปรับปรุงพันธุ์ข้าวโพด และเป็นเอกลักษณ์ประจำพันธุ์เพื่อเป็นข้อมูลอ้างอิงสำหรับตรวจสอบพันธุ์ข้าวโพด ทำประเมินลักษณะพันธุกรรมขององุ่น 63 พันธุ์ การทำลายพิมพ์ดีเอ็นเอด้วยเครื่องหมายโมเลกุลชนิด Microsatellite primer 28 คู่ พบว่าสามารถแบ่งพันธุ์องุ่นออกเป็น 2 กลุ่มที่แตกต่างกันอย่างชัดเจนคือ กลุ่ม A เป็นองุ่นรับปะทานสดทั้งหมด กลุ่ม B เป็นองุ่นทำไวน์และองุ่นป่ารวมถึงองุ่นรับประมานสดอีก 6 พันธุ์ นอกจากนั้น การศึกษาครั้งนี้ได้มีการเขียนโปรแกรมจัดทำฐานข้อมูลพันธุ์ดีเอ็นเอของพันธุ์องุ่นขึ้น เครื่องมือที่ใช้ในการพัฒนาระบบหรือเขียนโปรแกรมใช้ Miorosulf Visual Studio 2005 และโปรแกรมฐานข้อมูล MS-SQL Serer Express ASP.Net 2.0 ติดตั้งบน Internet ค านำ Insormation Serviec ภาษาที่ใช้ในโปรแกรมนี้ คือ ASP.Net 2.0 ส่วนกล้วยไม้รองเท้านารีที่เก็บรวบรวมไว้ โดยการประยุกต์ใช้เครื่องหมายโมเลกุล SSR ที่พัฒนาจากกล้วยไม้สกุลแวนด้ากับกล้วยไม้สกุลรองเท้านารี เพื่อลดค่าใช้จ่าย ศึกษาไพรเมอร์ทั้งหมดจำนวน 101 คู่สาย กับกล้วยไม้สกุลรองเท้านารี 25 ตัวอย่าง จาก 12 สายพันธุ์ พบว่ามี 61 คู่สายไพรเมอร์ ที่สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้ แบ่งกลุ่มความสัมพันธ์ได้เป็น 2 กลุ่ม กลุ่มที่ 1 ได้แก่ รองเท้านารีขาวพังงา รองเท้านารีขาวสตูล รองเท้านารีเหลืองปราจีน รองเท้านารีเกรยี่ และรองเท้านารีฝาหอย กลุ่มที่ 2 ได้แก่ รองเท้านารีเหลืองกระบี่ และไม้ป่าเกาะพนัก นอกจากนี้ได้มีการทำฐานข้อมูลของกล้วยไม้รองเท้านารี จัดเก็บในรูปแบบสื่ออิเลคทรอนิคส์ออนไลน์เพื่อให้ง่ายต่อการใช้งานของบุคคลทั่วไป และมีการออกแบบไว้เพื่อให้ผู้นำไปใช้สามารถปรับปรุงข้อมูลให้เป็นปัจจุบันได้อย่างง่าย โดยมีการเปิดให้ทดลองใช้ผ่านทาง http://www.plc.rmutl.ac.th/Database/result.php