08-03-2016, 04:39 PM
การตรวจสอบคลอสเตอโรไวรัสสาเหตุโรคเหี่ยวของสับปะรดโดยใช้กรดนิวคลีอิคตัวตรวจ
เยาวภา ตันติวานิช, วันเพ็ญ ศรีทองชัย และดารุณี ปุญญพิทักษ์
เยาวภา ตันติวานิช, วันเพ็ญ ศรีทองชัย และดารุณี ปุญญพิทักษ์
โรคเหี่ยวสับปะรด (Pineapple wilt disease หรือ Mealybug wilt of pineapple) ในประเทศไทยถูกรายงานว่าพบระบาดในแหล่งปลูกสับปะรดจังหวัดชลบุรี ตั้งแต่ปี พ.ศ. 2532 ได้ทดลองตรวจสอบตัวอย่างสับปะรดเป็นโรคเหี่ยวจากเชื้อไวรัส Pineapple mealybug wilt-associated virus (PMWaVs) ด้วยวิธี RT-PCR ที่ปรับปรุงมาจากกรรมวิธีของ Sether และ Hu (2002) ที่ใช้ชุดไพรเมอร์ 2 ชุด คือ ชุดที่ 1 ได้แก่ 5/ACAGGAAGGACAACACTCAC 3/ กับ5/ CGCACAAACTTCA AGCAATC 3/ ใช้ตรวจจำแนก PMWaV-1 และชุดที่ 2 ใช้ตรวจจำแนก PMWaV-2 ได้แก่ 5/ CATACGAACTAGACTCATACG 3/ กับ 5/CCATCCACCAATTTTACTAC 3/ สกัดอาร์เอ็นเอโดยใช้ชุด MasterPureTM Complete DNA and RNA Purification Kit (Epicentre® Biotechnologies)ได้อาร์เอ็นเอที่มีคุณภาพดี เมื่อนำมาสังเคราะห์ cDNA และเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอด้วยวิธี PCR ที่เหมาะสมที่ 94 องศาเซลเซียส 10 นาที 1 รอบ และบ่มปฏิกิริยาจำนวน 35 รอบของ 3 อุณหภูมิ สลับกันที่ denaturing temperature 94 องศาเซลเซียส 1 นาที 30 วินาที annealing temperature 55 องศาเซลเซียส 1 นาที 30 วินาที และ extension temperature 72 องศาเซลเซียส 1 นาที 30 วินาทีต่อด้วย 72 องศาเซลเซียส 10 นาที 1 รอบ ได้ดีเอ็นเอ ขนาด 589 นิวคลีโอไทด์ซึ่งเป็นส่วนของ HSP 70 homologus genesของเชื้อไวรัส PMWaV-1 และไม่พบชิ้นดีเอ็นเอขนาด 609 นิวคลีโอไทด์ ของเชื้อไวรัส PMWaV-2 จากนั้นโคลนดีเอ็นเอที่ได้เข้ากับพลาสมิดพาหะ แบบ cloning vector คือ pGEM-T easy (Promega) นั้น แต่ไม่สามารถเชื่อมต่อพลาสมิดพาหะเข้ากับ cDNA ของเชื้อไวรัสสาเหตุโรคเหี่ยวของสับปะรดได้