การตรวจสอบไวรัส Pineapple mealybug wilt-associated virus-1 และ -2 สาเหตุโรคเหี่ยว

[doa]

การตรวจสอบไวรัส Pineapple mealybug wilt-associated virus-1 และ -2 สาเหตุโรคเหี่ยวสับปะรดโดยเทคนิค multiplex PCR
วันเพ็ญ ศรีทองชัย, ปริเชษฐ์ ตั้งกาญจนภาสน์ และกาญจนา วาระวิชะนี
กลุ่มวิจัยโรคพืช สำนักวิจัยพัฒนาการอารักขาพืช

          การพัฒนาวิธีการตรวจสอบไวรัสสาเหตุโรคเหี่ยวสับปะรดทั้ง 2 strain (PMWaV-1 และ PMWaV-2) ในปฏิกิริยาเดียวกัน โดยอาศัยเทคนิค Multiplex RT-PCR เริ่มจากการออกแบบไพรเมอร์บริเวณ (1) Heat shock protein gene (HS) ที่มีความจำเพาะต่อไวรัส PMWaV-1 ได้แก่ PM1_HS_M_F และ PM1_HS_M_R ซึ่งให้แถบดีเอ็นเอขนาด 635 คู่เบส และไพรเมอร์ที่มีความจำเพาะต่อไวรัส PMWaV-2 ได้แก่ PM2_HS_M_F และ PM2_HS_M_R ซึ่งให้แถบดีเอ็นเอขนาด 380 คู่เบส ( 2) บริเวณ Coat protein gene (CP) ที่มีความจำเพาะต่อไวรัส PMWaV-1 ได้แก่ PM1_CP_M_F และ PM1_CP_M_R ซึ่งให้แถบดีเอ็นเอขนาด 428 คู่เบส และไพรเมอร์ที่มีความจำเพาะต่อไวรัส PMWaV-2 ได้แก่ PM2_CP_M_F และ PM2_CP_M_R ซึ่งให้แถบดีเอ็นเอขนาด 727 คู่เบส หลังจากการสกัดอาร์เอ็นเอของเชื้อ PMWaV-1 และ PMWaV-2 จากใบสับปะรดเป็นโรคโดยใช้ชุดสกัดสำเร็จรูป แล้วนำมาทดสอบและปรับระยะเวลารวมทั้งอุณหภูมิให้เหมาะสมในการสังเคราะห์เพิ่มปริมาณ cDNA โดยเทคนิค Multiplex RT-PCR พบว่า อุณหภูมิที่เหมาะสมสำหรับระยะ annealing ของ HS gene คือ 60 องศาเซลเซียส และ CP gene คือ 62 องศาเซลเซียส จากการทดสอบการใช้ไพรเมอร์ที่ออกแบบไว้จากยีน HS และ CP โดยเทคนิค multiplex RT-PCR เปรียบเทียบกับไพรเมอร์ที่ใช้ตรวจสอบ PMWaV-1 และ PMWaV-2 เพียง strain เดียว โดยเทคนิค RT-PCR ปรากฏว่า ให้ผลวิเคราะห์ด้วยวิธี gel electrophoresis ตรงกัน