การผลิตแอนติซีรัมของไวรัส Pineapple mealybug wilt-associated virus-1 สาเหตุโรคเหี่ยว

[doa]

การผลิตแอนติซีรัมของไวรัส Pineapple mealybug wilt-associated virus-1 สาเหตุโรคเหี่ยวสับปะรดโดยใช้ระบบเซลล์แบคทีเรีย
วันเพ็ญ ศรีทองชัย, ศรีเมฆ ชาวโพงพาง และกาญจนา วาระวิชะนี
กลุ่มวิจัยโรคพืช สำนักวิจัยพัฒนาการอารักขาพืช และภาควิชาโรคพืช มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์

          การผลิตแอนติซีรัมโดยใช้ระบบเซลล์แบคทีเรีย เริ่มจากนำใบสับปะรดที่เป็นโรคเหี่ยวมาแยกสกัดอาร์เอ็นเอ แล้วนำไปเพิ่มปริมาณด้วยเทคนิคอณูชีววิทยา โดยใช้ไพรเมอร์จากส่วนของยีนโปรตีนห่อหุ้มอนุภาคของเชื้อไวรัส PMWaV-1 ได้แก่ pet101_PMWaV1F (5’CACCATGGCTGA TTCGAGCAAACAAAAACAAC3’) และ pet101_PMWaV1R (5’TTTGCGTCCACCCATAAAGAT GTGCG3’) สังเคราะห์ ได้ชิ้นของดีเอ็นเอ ขนาด 771 คู่เบส จากนั้นนำไปโคลนเข้าสู่เวคเตอร์ pET 101/D-TOPO® (Invitrogen) และคัดเลือกเฉพาะโคลนที่มีชิ้นดีเอ็นเอที่ใส่เข้าไปในพาหะ นำมาทำให้บริสุทธิ์ จากนั้นคัดเลือกโคลนที่สามารถสังเคราะห์โปรตีนได้ในเซลล์ของแบคทีเรีย E. coli BL 21 (DES 3) ในอาหารสูตร 2XYT ที่เติมสารปฏิชีวนะแอมพิซิลิน 100 มิลลิกรัมต่อลิตร และใช้สารไอพีทีจี ในการชักนำให้เกิดการสังเคราะห์โปรตีนพบว่า ระยะเวลาที่สามารถสังเคราะห์โปรตีนได้สูงสุด คือ 24 ชั่วโมง โดยให้โปรตีนที่มีขนาดประมาณ 28 กิโลดาลตัน ทำการแยกโปรตีนของเชื้อให้บริสุทธิ์ด้วย Ni-NTA column เพื่อนำไปผลิตโพลีโคลนอลแอนติบอดีในกระต่าย ผลการตรวจสอบคุณภาพของแอนติซีรัมที่ได้ด้วยวิธี indirect ELISA พบว่า แอนติซีรัมจากการเจาะเลือดครั้งที่ 5 - 7 มีประสิทธิภาพสูงสุด สามารถทำปฏิกิริยาได้ถึง 1:10,000 จากนั้นทำการทดสอบประสิทธิภาพของแอนติซีรัมกับตัวอย่างสับปะรดที่แสดงอาการเหี่ยว โดยเปรียบเทียบชนิดของเพลทพบว่า โพลีซอฟท์ เพลท ของ Nunc ให้ปฏิกิริยาดีที่สุด แต่ให้ปฏิกิริยาค่อนข้างต่ำ ทำให้อ่านผลยาก แอนติซีรัมที่ผลิตได้อาจเหมาะนำไปใช้ในการตรวจหาไวรัสโดยวิธี Immunosorbent electron microscopy (IEM)