การผลิตแอนติซีรัมของไวรัส Pineapple mealybug wilt-associated virus-2 สาเหตุโรคเหี่ยว

[doa]

การผลิตแอนติซีรัมของไวรัส Pineapple mealybug wilt-associated virus-2 สาเหตุโรคเหี่ยวสับปะรดโดยใช้ระบบเซลล์แบคทีเรีย
วันเพ็ญ ศรีทองชัย, ศรีเมฆ ชาวโพงพาง และเยาวภา ตันติวานิช
กลุ่มวิจัยโรคพืช สำนักวิจัยพัฒนาการอารักขาพืช

          นำใบสับปะรดที่เป็นโรคเหี่ยวมาแยกสกัดอาร์เอ็นเอ โดยใช้ชุดสกัดอาร์เอ็นเอสำเร็จรูป (RNeasy Kit ของ QIAGEN) แล้วนำไปเพิ่มปริมาณด้วยเทคนิค RT-PCR โดยใช้ไพรเมอร์จากส่วนของยีนโปรตีนห่อหุ้มอนุภาคของเชื้อไวรัส PMWaV-2 ได้แก่ Lumi_PMWaV2F (5' CACCGCTCAGAATTACGTAGCCGTAGTAGA 3') และ Lumi_PMWaV2R (5'CCCTGAAACAGCTCCCTGGTTCAGCT 3') สังเคราะห์ได้ชิ้นของดีเอ็นเอขนาด 909 คู่เบส จากนั้นนำไปโคลนเข้าสู่ cloning vector (pCR®8/GW/TOPO® , Invitrogen) และคัดเลือกเฉพาะโคลนที่มีชิ้นดีเอ็นเอที่ใส่เข้าไปใน vector นำมาทำให้บริสุทธิ์โดยวิธี Miniprep และมีลำดับนิวคลีโอไทด์ 909 คู่เบส หลังจากนั้น subclone ยีนโปรตีนห่อหุ้มอนุภาคของไวรัส PMWaV-2 เข้าสู่ protein expression vector (pET160/GW/D-TOPO® , Invitrogen) ซึ่งมีขนาด 5.8 กิโลเบส และ transform เข้า E.coli Top 10 ตรวจพบว่ามีลำดับนิวคลีโอไทด์ 1041 คู่เบส คัดเลือกโคลนที่สามารถสังเคราะห์โปรตีนได้ในเซลล์ของ E. coli BL 21 (DES 3) ในอาหาร 2XYT ที่เติมสารปฏิชีวนะ ampicillin 100 มิลลิกรัม/ลิตร และที่เติมสารปฏิชีวนะ ampicillin 100 มิลลิกรัม/ลิตร และใช้สาร Isopropyl-β-D thiogalactopyranoside (IPTG) ในการชักนำให้เกิดการสังเคราะห์โปรตีน ซึ่งพบว่าระยะเวลาที่สามารถสังเคราะห์โปรตีนได้สูงสุด คือ 24 ชั่วโมง โดยให้โปรตีนที่มีขนาดประมาณ 38 กิโลดาลตัน จากการตรวจปริมาณโปรตีนทีหลังการแยกให้บริสุทธิ์ด้วย Ni-NTA column ด้วยเทคนิค SDSPAGE ปรากฏว่าพบ band ขนาด 38 กิโลดาลตันในทุก fraction และพบว่า โปรตีนสามารถผ่าน column Ni-NTP ได้น้อยมาก ขณะนี้กำลังทำการปรับ pH ของบัฟเฟอร์ชนิดต่างๆที่ใช้ในการแยกโปรตีนให้บริสุทธิ์ด้วย Ni-NTA เพื่อไม่ให้โปรตีนถูกชะล้างไปในขั้นตอนของการล้าง column