09-17-2018, 11:16 AM
การใช้เครื่องหมายโมเลกุลในการจำแนกและปรับปรุงพันธุ์พืช
ประสาน สืบสุข
ประสาน สืบสุข
ทุเรียนเป็นหนึ่งในไม้ผลที่มีความสำคัญมากของประเทศไทย มีการปลูกแพร่หลายตามภาคต่างๆ ของประเทศทำให้เกิดความซ้ำซ้อนในการตั้งชื่อ และข้อมูลด้านเครื่องหมายโมเลกุลที่ใช้ตรวจสอบพันธุ์มีไม่เพียงพอ จึงได้พัฒนาเครื่องหมายโมเลกุล SSR ด้วยเทคโนโลยีการวิเคราะห์ลำดับเบสยุคใหม่ (NGS) ผลจากการศึกษานี้ สามารถหาลำดับเบสรวมได้ 25,909,606,800 เบส จากข้อมูลชิ้นลำดับเบส (raw read) จำนวน 30,107,9102 read จากการรวม raw read ให้เป็นชิ้นดีเอ็นเอที่ยาวขึ้น (contig) ได้ 424,882 contig เมื่อนำข้อมูลเหล่านี้ไปค้นหาเครื่องหมาย SSR พบว่าสามารถออกแบบไพรเมอร์ได้จำนวน 11,156 คู่ไพรเมอร์ โดยไพรเมอร์ที่มีลำดับเบสซ้ำแบบซ้ำสองมีมากที่สุด 6,545 (58.67%) คู่ไพรเมอร์ รองลงมา คือ ลำดับเบสซ้ำสาม 2,295 (20.57%) คู่ไพรเมอร์ ลำดับเบสซ้ำหก 1,056 (9.47%) คู่ไพรเมอร์ ลำดับเบสซ้ำสี่ 781 (7.00%) คู่ไพรเมอร์ และลำดับเบสซ้ำห้า 479 (4.29%) คู่ไพรเมอร์ และได้คัดเลือกหาไพรเมอร์ที่ให้แถบดีเอ็นเอแตกต่าง พบไพรเมอร์ SSR 17 คู่ ให้รูปแบบการเกิดแถบดีเอ็นเอที่เกิดความแตกต่างกันในทุเรียน 40 พันธุ์ พบรูปแบบอัลลีลที่แตกต่างกัน 73 อัลลีล โดยแต่ละไพรเมอร์ให้อัลลีลที่ต่างกันตั้งแต่ 2 - 8 อัลลีล ดังนั้นจึงสามารถสรุปได้ว่าเครื่องหมายโมเลกุล SSR ที่พัฒนาได้จากการทดลองนี้สามารถใช้แยกความแตกต่างทางพันธุกรรมของทุเรียนที่เป็นพันธุ์เดียวกัน แต่ปลูกในพื้นที่ต่างกัน และแต่มีชื่อเรียกต่างกันได้ และใช้เป็นข้อมูลอ้างอิงสำหรับตรวจสอบความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมของทุเรียน อีกทั้งยังประโยชน์สำหรับการปรับปรุงพันธุ์
อินทผลัมเป็นไม้ผลที่มีความสำคัญทางเศรษฐกิจชนิดหนึ่ง ต้นที่เพาะจากเมล็ดต้องรอให้ออกดอก 3 - 7 ปี ถึงจะทราบเพศทำให้เสียเวลาและค่าใช้จ่ายในการดูแลรักษา การทดลองนี้จึงได้ศึกษาและพัฒนาวิธีการตรวจสอบเพศอินทผลัมในระยะต้นกล้าด้วยเครื่องหมายโมเลกุล จากการทดสอบไพรเมอร์พบว่า ไพรเมอร์ DpDOAF และ DpDOAR สามารถแยกเพศอินทผลัมได้ด้วยเทคนิคพีซีอาร์ โดยแสดงแถบดีเอ็นเอเฉพาะในต้นตัวผู้มีขนาด 450 เบส การทดสอบความแม่นยำของเครื่องหมายโมเลกุลกับต้นอินทผลัมที่ทราบเพศแล้ว จำนวน 169 ต้น พบผลการตรวจเพศไม่ตรงตามเพศจำนวน 8 ต้น คิดเป็นร้อยละ 4.7 มีความแม่นยำของเครื่องหมายโมเลกุลคิดเป็น 95.3 เปอร์เซ็นต์ ในส่วนของการพัฒนาวิธีการตรวจสอบเพศอินทผลัมด้วยวิธีการสกัดดีเอ็นเอจากการตีลูกเหล็ก พบมีความบริสุทธิ์เทียบเท่ากับการสกัดด้วยวิธี CTAB แต่รวดเร็วกว่า สำหรับการตรวจสอบเพศอินทผลัมด้วยเทคนิค High Resolution Melting (HRM) โดยใช้ไพรเมอร์ DpHRM พบว่าสามารถแยกเพศเมียออกจากเพศผู้ได้ และตรวจสอบตัวอย่างจำนวนมากได้อย่างรวดเร็ว จึงเป็นอีกหนึ่งทางเลือกในการตรวจเพศอินทผลัมในระดับต้นกล้า
จากการสุ่มนำไพรเมอร์ชนิด SSR ที่พัฒนาจากกล้วยไม้สกุลแวนด้าทั้งหมด จำนวน 70 คู่สาย มาทำ PCR กับตัวอย่างกล้วยไม้สายพันธุ์สกุลหวาย ทั้งหมด 5 สายพันธุ์ พบว่ามีเพียงไพรเมอร์ 3 คู่สายที่สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอจากตัวอย่างได้ คือ ไพรเมอร์ Vandbirdo_022 Vandbirdo_026 และ Vandbirdo_094 สามารถเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอได้ขนาดแถบแบน จากไพรเมอร์ Vandbirdo_022 ประมาณ 240 คู่เบส เมื่อนำไปเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอโดยใช้ไพรเมอร์ติดสีฟลูออเรสเซนต์ที่จำเพาะ 3 ไพรเมอร์ กับดีเอ็นเอกล้วยไม้ 96 สายพันธุ์ หลังจากเพิ่มปริมาณด้วยวิธี PCR แล้ว ตรวจสอบขนาดดีเอ็นเอที่ได้จากปฏิกิริยา PCR ด้วย 1% agarose gel electrophoresis พบว่าไพรเมอร์ Vandbirdo_026 สามารถเพิ่มปริมาณจำนวนดีเอ็นเอกับตัวอย่างสายพันธุ์กล้วยไม้ 74 ตัวอย่าง ขนาดแถบดีเอ็นเอประมาณ 280 คู่เบส และไพรเมอร์ Vandbirdo_094 สามารถเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอกับตัวอย่างสายพันธุ์กล้วยไม้ได้ 80 ตัวอย่าง ขนาดแถบดีเอ็นเอประมาณ 240 คู่เบส แต่เครื่องหมายดีเอ็นเอที่ได้ยังไม่เพียงพอสำหรับการจำแนกกล้วยไม้สกุลหวายได้ จึงได้ปรับใช้เทคนิคอื่น ได้แก่ การคัดเลือกเครื่องหมายดีเอ็นสำหรับการอ่านข้อมูลดีเอ็นเอบาร์โค๊ด จากการรวบรวมตัวอย่างกล้วยไม้จากฟาร์มเกษตรกรที่นำพันธุ์พืชมาจดทะเบียนพันธุ์ที่กรมวิชาการเกษตร กล้วยไม้สกุลหวายพื้นเมืองที่เก็บรวบรวมไว้ที่ศูนย์วิจัยพืชสวนเชียงราย จำนวน 30 สายพันธุ์ เพื่อนำมาทดสอบกับเครื่องหมายดีเอ็นเอชนิดบาร์โค๊ด โดยการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอยีนต่างๆ จำนวน 4 ยีน ได้แก่ matK, ITS, trnH-psbA และ rbcl แล้วนำผลผลิตดีเอ็นเอที่ได้จากการเพิ่มปริมาณด้วยวิธีพีซีอาร์ไปหาลำดับนิวคลีโอไทด์ด้วยเครื่องอ่านลำดับนิวคลีโอไทด์อัตโนมัติโดยบริษัทเอกชนและเปรียบเทียบข้อมูลกับฐานข้อมูล GenBank ได้ชื่อกล้วยไม้พร้อมทั้งสามารถจัดกลุ่มชนิดของกล้วยไม้หวายได้ เมื่อวิเคราะห์ข้อมูล phylogenetic tree โดยใช้ ClustalWII Phylogeny ผลการวิเคราะห์พบว่า สามารถจำแนกชนิดของกล้วยไม้สกุลหวายทั้ง 30 สายพันธุ์ ด้วยไพรเมอร์ rbcl และmatK ซึ่งจะนำไปใช้เป็นเครื่องหมายดีเอ็นเอสำหรับทำลายพิมพ์ดีเอ็นเอของกล้วยไม้สกุลหวายชนิดต่าง ๆ ต่อไป
โรคใบไหม้แผลใหญ่ (Northern Corn Leaf Blight, NCLB) ที่เกิดจากเชื้อรา Exserohilum turcicum เป็นปัญหาสำคัญอย่างมากต่อการผลิตข้าวโพดในประเทศไทย ที่ทำความเสียหายให้กับข้าวโพด ส่งผลกระทบให้ผลผลิตลดลง 30 - 40 เปอร์เซ็นต์ โดยจะขึ้นอยู่กับความรุนแรงของเชื้อและระยะการเจริญเติบโตของข้าวโพด การป้องกันความเสียหายจากโรคใบไหม้แผลใหญ่ที่มีประสิทธิภาพและประหยัดมากที่สุด คือ การใช้พันธุ์ต้านทานโรค การวิจัยครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อใช้เครื่องหมายโมเลกุลเอสเอสอาร์และสการ์ตรวจหาความต้านทานโรคใบไหม้แผลใหญ่ในเชื้อพันธุกรรมข้าวโพด จากการใช้เครื่องหมายโมเลกุลเอสเอสอาร์ 12 คู่ไพรเมอร์ ตรวจหาความต้านทานโรคใบไหม้แผลใหญ่ในพันธุ์ข้าวโพดที่พันธุ์ต้านทานและพันธุ์อ่อนแอต่อโรค พบว่าไพรเมอร์ umc2037 bnlg1233 และ bnlg1607 ให้รูปแบบการเกิดแถบดีเอ็นเอที่มีความแตกต่างระหว่างข้าวโพดพันธุ์อ่อนแอต่อโรคและข้าวโพดพันธุ์ที่ต้านทานต่อโรคใบไหม้แผลใหญ่ และน่าจะมีความเกี่ยวข้องกับความอ่อนแอต่อโรคใบไหม้แผลใหญ่ในข้าวโพด การใช้เครื่องหมายโมเลกุลสการ์ SCA07496 SCA16420 SCB09464 และ SCE20429 ตรวจหาความต้านทานโรคใบไหม้แผลใหญ่ในพันธุ์ข้าวโพดเลี้ยงสัตว์ พบว่าเครื่องหมายโมเลกุลสการ์ทั้ง 4 เครื่องหมายให้รูปแบบการเกิดแถบดีเอ็นเอไม่สัมพันธ์กับการต้านทานต่อโรคกับพันธุ์ข้าวโพดเลี้ยงสัตว์ที่ได้ทำการศึกษา
การศึกษาความทนทานต่อสภาพน้ำท่วมและสภาพแห้งแล้งของถั่วเหลืองพันธุ์รับรองของกรมวิชาการเกษตรทั้งลักษณะทางสรีรวิทยาและลักษณะทางพันธุกรรม จำนวน 20 พันธุ์ ประกอบด้วยถั่วเหลืองพันธุ์รับรองของกรมวิชาการเกษตร 18 พันธุ์ และถั่วเหลืองที่ใช้เป็นพันธุ์ควบคุม (control) 2 พันธุ์ ได้แก่ อุตสาหะ-เอ และ Williams ในส่วนของลักษณะทางสรีรวิทยาได้ทำการทดสอบความทนทานต่อสภาพน้ำท่วมของถั่วเหลืองระยะแรกงอก และการทดสอบความทนทานต่อสภาพแห้งแล้งของถั่วเหลืองระยะแรกงอกโดยใช้สาร Polyethylene glycol (PEG) แต่ละการทดลองวางแผนแบบ 2 x 20 Factorial in CRD จำนวน 4 ซ้ำ จากนั้นวิเคราะห์ผลทางสถิติโดยใช้วิธี Analysis of variance พบว่า ถั่วเหลืองแต่ละพันธุ์มีความทนทานต่อสภาพน้ำท่วมแตกต่างกัน พันธุ์ที่มีความทนทานต่อสภาพน้ำท่วมมากที่สุดใน 3 อันดับแรก ได้แก่ พันธุ์ศรีสำโรง 1 พันธุ์เชียงใหม่ 2 และพันธุ์สุโขทัย 1 พันธุ์ที่มีความอ่อนแอต่อสภาพน้ำท่วมมากที่สุดใน 3 อันดับแรก ได้แก่ พันธุ์เชียงใหม่ 1 พันธุ์เชียงใหม่ 5 และพันธุ์ สจ.4 สำหรับสภาพแห้งแล้ง พันธุ์ที่มีความทนทานต่อสภาพแห้งแล้งมากที่สุดใน 3 อันดับแรก ได้แก่ พันธุ์ศรีสำโรง 1 พันธุ์เชียงใหม่ 2 และพันธุ์สุโขทัย 1 พันธุ์ที่มีความอ่อนแอต่อสภาพแห้งแล้งมากที่สุดใน 3 อันดับแรก ได้แก่ พันธุ์เชียงใหม่ 1 พันธุ์เชียงใหม่ 84-2 และพันธุ์เชียงใหม่ 6 เมื่อคำนวณหาค่าความสัมพันธ์ (Correlation) ระหว่างความทนทานต่อสภาพแห้งแล้งกับความทนทานต่อสภาพน้ำท่วมของถั่วเหลืองระยะแรกงอกในแต่ละพันธุ์ พบว่ามีความสัมพันธ์ (Correlation) เชิงบวกระหว่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ ผลจากงานวิจัยนี้ทำให้ทราบว่าถั่วเหลืองพันธุ์รับรองพันธุ์ใดเหมาะสมต่อสภาพน้ำท่วมและสภาพแห้งแล้งที่เกิดขึ้นในช่วงปลูกถั่วเหลืองรวมถึงระยะแรกงอก สามารถนำไปเผยแพร่แก่เกษตรกรให้ปลูกในพื้นที่ที่ประสบปัญหาดังกล่าวได้ อย่างไรก็ตาม การต่อยอดงานวิจัยนี้โดยการศึกษาสารพันธุกรรมของถั่วเหลืองพันธุ์รับรองของกรมวิชาการเกษตรด้วยเครื่องหมายโมเลกุลและยีนที่เกี่ยวข้องกับระบบความทนทานต่อสภาพน้ำท่วมหรือสภาพแห้งแล้ง คาดว่าจะเป็นประโยชน์ในการทำความเข้าใจเกี่ยวกับระบบความทนทานต่อสภาพน้ำท่วมและสภาพแห้งแล้งของถั่วเหลืองในระดับยีน รวมถึงสามารถนำเครื่องหมายโมเลกุลและยีนที่มีประสิทธิภาพในการคัดเลือกพันธุ์ที่ทนทานต่อสภาพน้ำท่วมและสภาพแห้งแล้งไปใช้ในการคัดเลือกและปรับปรุงพันธุ์ถั่วเหลืองในอนาคต