การผลิตไบโอเอทานอลจากชีวมวลโดยใช้เทคโนโลยีชีวภาพ

[doa]

การผลิตไบโอเอทานอลจากชีวมวลโดยใช้เทคโนโลยีชีวภาพ
บุญเรือนรัตน์ เรืองวิเศษ

          จากการคัดเลือกจุลินทรีย์ที่ประสิทธิภาพในการย่อยสลายลิกนินที่มีอยู่ในห้องปฏิบัติการ พบเชื้อจุลินทรีย์ที่สามารถเจริญเติบโตและผลิต ligninolytic enzymes บนอาหารแข็งทดสอบที่มีสาร Azure-B ABTS และ Guaiacol จำนวนทั้งสิ้น 20 ไอโซเลท ซึ่งสามารถผลิตเอนไซม์แลคเคสได้ดี เมื่อนำมาทดสอบประสิทธิภาพในการผลิตเอนไซม์ย่อยสลายลิกนินพบว่า เชื้อไอโซเลทที่มีประสิทธิภาพดีที่สุด 3 ไอโซเลท คือ Rigido G1 และหลินจือ เมื่อนำลำดับเบสมาเปรียบเทียบกับฐานข้อมูล NCBI พบว่าคล้ายคลึงกับเชื้อรา 2 ชนิด คือ Ganoderma lucidum และ Rigidoporus microporus

          ทำการคัดเลือกจุลินทรีย์ที่มีประสิทธิภาพในการย่อยสลายไซลาเนสแล้วนำมาโคลนยีนที่เกี่ยวข้องกับการย่อยสลายชีวมวลที่เป็นโครงสร้างของลิกโนเซลลูโลส จำนวน 3 ยีนได้แก่ ?-D-Xylosidase, endo-1,4-?-xylanase และ alpha-L-arabinofuranosidase แล้วถ่ายเข้าสู่เซลล์ยีสต์ สามารถคัดเลือกยีสต์ที่ได้รับการถ่ายยีน นำเซลล์ยีสต์ที่ได้มาตรวจสอบการปรากฏของยีนด้วยเทคนิคพีซีอาร์โดยใช้ไพรเมอร์ AOX ที่อยู่กับเวคเตอร์ เลี้ยงกระตุ้นการแสดงออกของยีนในอาหาร MGYH และกระตุ้นโดยการเติมเมทานอล พบว่ายีสต์ที่ได้สามารถผลิตโปรตีนได

          จากการทดลองผลิตเอนไซม์ที่ย่อยสลายลิกโนเซลลูโลสได้ดี ได้แก่ เอนไซม์เซลลูเลส และเอนไซม์ไซลาเนส โดยการศึกษาหาสับสเตรทที่เหมาะสมพบว่า เมื่อใช้เห็ดแครงเป็นจุลินทรีย์สำหรับผลิตเอนไซม์นั้น พบว่าสับสเตรทที่เหมาะสม ได้แก่ เปลือกข้าวโพด รองลงมา ได้แก่ หญ้าเนเปียร์ปากช่อง1 และต้นเลา ตามลำดับ วัสดุที่เหมาะสมในการนำมาผลิตเอนไซม์ด้วยเชื้อรา A. niger ได้แก่ ไซแลน หญ้าเนเปียร์ปากช่อง1 และเปลือกข้าวโพด และจะนำผลการทดลองไปขยายผลสู่การผลิตระดับอุตสาหกรรมขนาดเล็กต่อไป

          การคัดเลือกและโคลนยีนสำหรับการสร้างยีสต์ได้ผลการโคลนยีน Xylose reductase สามารถโคลนยีน Xylose reductase ได้จากเชื้อรา Neurospora sp. ยีน endo Xylanase ได้จากเชื้อรา Aspergillus niger และยีน Xylital dehydrogenase ได้จากเชื้อรา Trichoderma sp. แล้วส่งถ่ายเข้า เชื้อยีสต์ Saccharomyces cerevisiae พบว่ายีสต์ (Saccharomyces cerevisiae) ที่ได้รับการถ่ายฝาก ยีน Xylose reductase มีประสิทธิภาพในการย่อยสลายเซลลูโลสและลิตเอทานอลได้สูงกว่าที่ยีสต์ที่ไม่ได้รับการถ่ายยีนถึง 11.35%

          การผลิตเอนไซม์ในถังหมักขนาดย่อมเป็นงานวิจัยที่ได้นำเทคโนโลยีทางด้านการผลิตเอนไซม์มาศึกษาการพัฒนาสายพันธุ์จุลินทรีย์ และการผลิตเอนไซม์เพื่อผลิตไบโอเอทานอลจากชีวมวล โดยใช้เชื้อเห็ดแครง และเชื้อ Aspergillus niger เป็นกล้าเชื้อในการทดลอง ซึ่งการทดลองของเชื้อเห็ดแครง ได้ใช้เปลือกข้าวโพดบดเป็นวัสดุหลักในการหมักเชื้อ ส่วนการทดลองของเชื้อ Aspergillus niger ใช้หญ้าเนเปียบดเป็นวัสดุหลักในการหมัก ปริมาตร 300 ลิตร ต่อการทดสอบเชื้อหนึ่งตัวอย่าง จากนั้นเดินเครื่องการทำงานของถังหมัก โดยการกวนของใบพัด และเก็บตัวอย่างส่วนน้ำใส เพื่อนำไปวัดค่า ทดสอบประสิทธิภาพของเอนไซม์ด้วยเทคนิค Congored diffusion assay เตรียมอาหารแข็งที่มีซับเสรตต่างๆ เป็นองค์ประกอบพบว่าเอนไซม์ที่ผลิตได้นั้น มีประสิทธิภาพในการย่อยสลายชีวมวลต่างๆ ได้

          ด้านการศึกษาชนิดของพืชชีวมวลในประเทศไทยที่เหมาะสมในการนำมาผลิตไบโอเอทานอล เช่น ศักยภาพของสาหร่ายกับชีวมวลจากพืชที่ให้เซลลูโลสสูง ที่ไม่ใช่พืชอาหาร ปลูกง่ายในทุกสภาพพื้นที่ โตเร็ว ซึ่งเป็นวัตถุดิบที่ดีที่จะนำมาใช้ในการผลิตไบโอเอทานอล ดังนั้น การทดลองนี้จึงได้ทำการศึกษา คัดเลือก และทดสอบพืชที่มีศักยภาพในการผลิตไบโอเอทานอล โดยเริ่มดำเนินการตั้งแต่ปี 2556 - 2557 สำรวจและรวบรวมชนิดพืชที่มีศักยภาพในการผลิตเอทานอลในพื้นที่เขตภาคตะวันออกเฉียงเหนือ ได้แก่ จังหวัดนครราชสีมา และจังหวัดขอนแก่น ได้เก็บพันธุ์และพืชที่มีศักยภาพในการผลิตเอทานอลได้จำนวน 5 ชนิด ได้แก่ ต้นเลา หญ้าเนเปียร์ (ขอนแก่น) หญ้าคิงเนเปียร์ (ปากช่อง1) อ้อยพลังงาน (ลูกผสม KJ) และสาหร่ายขนาดเล็ก นำไปทดสอบการผลิตน้ำตาลพบว่าช่วงวันที่ 6 - 9 ที่มีปริมาณน้ำตาลรีดิวซ์สูงสุดไปทดสอบกระบวนการหมักด้วยยีสต์ในสภาพไร้ออกซิเจนเป็นระยะเวลา 5 วัน พบว่าสาหร่ายขนาดเล็กสามารถย่อยสลายเป็นน้ำตาลกลูโคสได้ดีและเร็วที่สุดตั้งแต่วันที่ 1 รองลงมา ต้นเลา หญ้าคิงเนเปียร์ (ปากช่อง1) หญ้าเนเปียร์ (ขอนแก่น) และอ้อยพลังงาน ตามลำดับ

          ได้ทำการเก็บรวมรวม ศึกษาชนิดและปริมาณชีวมวลที่มีศักยภาพในการผลิตไบโอทานอลและในแต่ละพื้นที่ สวพ. กรมวิชาการเกษตร ตัวอย่างชีวมวล ได้แก่ เปลือกยูตาลิปตัส อ้อยพลังงาน และทะลายปาล์ม ในการผลิตไบโอเอทานอล นำมาผ่านกระบวนการ pre-treatment ด้วย NaOH ที่ 0.4, 1, 2 และ 20 % ตามลำดับ เพื่อแยกลิกนินออก นำไปหมักให้เป็นน้ำตาลและแอลกอฮอล์ ก่อนตรวจวิเคราะห์ปริมาณเซลลูโลสเฮมิเซลลูโลส ลิกนิน และปริมาณน้ำตาลและแอลกอฮอล์หลังหมัก ทำการทดลองและวิเคราะห์ผลที่ศูนย์วิจัยเกษตรวิศวกรรมขอนแก่นและสำนักวิจัยพัฒนาเทคโนโลยีชีวภาพ กรมวิชาการเกษตรระหว่างปี พ.ศ. 2556 ถึง พ.ศ. 2557 ผลการทดลองพบว่า เปอร์เซ็นต์การย่อยลิกนินของชีวมวลมีค่าต่ำสุด และเปอร์เซ็นต์การย่อยเฮมิเซลลูโลสมีค่าสูงสุด รองลงมา คือ เซลลูโลส

          การโคลนยีนที่ควบคุมการสร้างลิกนินในพืชมีวัตถุประสงค์เพื่อโคลนยีนและศึกษาคุณสมบัติของยีนที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการสร้างลิกนินในพืชและสร้างชุด cassette ยีนในรูปแบบ antisense เพื่อยับยั้งการแสดงออกของยีน สำหรับนำไปถ่ายฝากเข้าสู่พืชเพื่อใช้ในกระบวนการปรับปรุงพันธุ์พืชให้มีปริมาณลิกนินต่ำเหมาะสมกับการนำไปผลิตไบโอเอทานอล โดยยีนที่ทำการโคลนในครั้งนี้มีจำนวน 4 ยีน ได้แก่ 4-coumarate:CoA ligase (4CL), cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD), caffeic acid O-methyltransferase (COMT) และ caffeoyl coenzyme A O-methyltransferase (CCOMT) เป็นเอนไซม์ที่มีบทบาทสำคัญในกระบวนการสังเคราะห์ลิกนินในพืช งานวิจัยนี้ได้ทำการโคลนยีน 4CL CAD COMT และ CCOMT จากหญ้าคิงเนเปียร์ (KN) และหญ้าคิงเนเปียร์ลูกผสมปากช่อง 1 (KP) ซึ่งเป็นพืชชีวมวลทางเลือกสำหรับนำมาผลิตไบโอเอทานอล สามารถนำชุดยีนดังกล่าวไปศึกษาการแสดงออกของยีนโดยการถ่ายฝากเข้าสู่พืชชีวมวล เช่น หญ้าคิงเนเปียร์ อ้อย และเลา เป็นต้น เพื่อการปรับปรุงพันธุ์พืชให้มีปริมาณลิกนินต่ำเหมาะสมกับการนำไปผลิตไบโอเอทานอลต่อไป

          ทำการถ่ายฝากยีนเพื่อยับยั้งขบวนการสร้างลิกนินให้มีปริมาณลิกนินต่ำเพื่อการผลิตไบโอเอทานอล โดยศึกษาสูตรอาหารที่เหมาะสมในการชักนำใบอ่อนของหญ้าเนเปียร์พันธุ์ปากช่อง 1 ให้เกิดแคลลัสและยอด นำไปใช้ในการถ่ายยีนได้ การเลือกใช้แคลลัสของหญ้าเนเปียร์ปากช่อง1 มาถ่ายยีนโดยวิธี Leaf disc โดยใช้ A. tumefaciens สามารถชักนำให้ชิ้นส่วนใบยาสูบที่ได้รับการถ่ายยีนเกิดต้นใหม่ได้

          Chlamydomonas reinhardtii คือ สาหร่ายสีเขียวเซลล์เดียว เป็นเทคโนโลยีชีวภาพที่ถูกนำมาใช้เป็นต้นแบบและผลิตภัณฑ์ มีคุณสมบัติโตเร็ว เลี้ยงง่าย เจริญเติบโตโดยการสังเคราะห์แสงเพียงอย่างเดียว สามารถสะสมคาร์โบไฮเดรตไว้ในเซลล์ซึ่งสามารถนำมาเป็นชีวมวลได้ การทดลองนี้จึงศึกษาผลของการถ่ายฝากยีนที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการเมตาบอลิซึมของน้ำตาลซูโครส ได้แก่ ยีน Sucrose synthase (SUS) เพื่อใช้เป็นสาหร่ายชีวมวล ทำการสร้างเวคเตอร์สำหรับถ่ายยีน SUS ให้ได้ดีเอ็นเอสายผสมที่อยู่ในเวคเตอร์ pChlamy3 มีขนาด 6947 เบส เพื่อถ่ายยีนเข้าสาหร่ายพบว่า ได้สาหร่าย Chlamydomonas reinhardtii C.137 ที่ได้รับการถ่ายยีน SUS (C.137+SUS) จำนวน 1 ไอโซเลต

          ได้ทำการศึกษาการทดสอบพืชและสาหร่ายชีวมวลในประเทศไทยเพื่อทดแทนพืชพลังงานเปรียบเทียบกับสาหร่ายนำเข้าจากต่างประเทศที่เหมาะสมสำหรับผลิตไบโอเอทานอล โดยเริ่มดำเนินการตั้งแต่ปี 2557 - 2558 รวบรวมชนิดพืช/สาหร่ายที่มีศักยภาพในการผลิตเอทานอลจำนวน 6 ชนิด ได้แก่ ต้นเลา หญ้าเนเปียร์(ขอนแก่น) หญ้าคิงเนเปียร์ (ปากช่อง1) อ้อยพลังงาน (ลูกผสม KJ) สาหร่าย Chlorella pyrenoidosa (ADOA4) เปรียบเทียบกับ Chlorella sp. (J1) จากประเทศญี่ปุ่น

          ได้นำเข้าจุลินทรีย์และยีสต์ผลิตเอทานอลจากต่างประเทศมาศึกษาเปรียบเทียบประสิทธิภาพจุลินทรีย์นำเข้าจากต่างประเทศที่ใช้ในการผลิตไบโอเอทานอลเทียบกับจุลินทรีย์ท้องถิ่น เพื่อลดต้นทุนและเพิ่มประสิทธิภาพในการผลิตไบโอเอทานอล สามารถแยกเชื้อยีสต์ที่แตกต่างกันได้ 25 ไอโซเลต

          ด้านเครื่องจักรในการผลิตเอทานอลได้พัฒนาและปรับปรุงเครื่องจักรกลต้นแบบให้สามารถใช้ในการแปรสภาพชีวมวลในขบวนการผลิตเอทานอลให้มีประสิทธิภาพ ทำการออกแบบและสร้างต้นแบบเครื่องมือแปรสภาพชีวมวลสำหรับผลิตเอทานอล ได้แก่ เครื่องหั่นย่อยเศษวัสดุเหลือใช้ทางการเกษตร และพืชพลังงาน ที่มีคุณสมบัตินำไปผลิตเอทานอลได้ เช่น ทะลายปาล์ม หญ้าเนเปียร์ ต้นเลา และอ้อยพลังงาน ทดสอบและประเมินผลเครื่องต้นแบบ หาสมรรถนะและประสิทธิภาพการทำงาน สามารถทำการแปรสภาพวัสดุพืชชีวมวลที่มีสภาพแห้งได้ดีกว่าสภาพวัสดุที่สดหรือมีความชื้นสูง เพราะฉะนั้นก่อนการหั่นย่อยแปรสภาพวัสดุต้องทำการตากแดดให้แห้งก่อนเสมอ

          ได้ทำการวิจัยและพัฒนาเครื่องจักรกลในกระบวนการหมักของการผลิตเอทานอลจากชีวมวล เป็นการบูรณาการเครื่องจักรและเทคโนโลยีชีวภาพเพื่อผลิตพลังงาน โดยเครื่องจักรในกระบวนการผลิตจะต้องประกอบด้วย เครื่องสับย่อยหยาบและเครื่องบดหยอดละเอียดเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการทำงานของจุลินทรีย์ โดยกระบวนการเตรียมวัตถุดิบก่อนใช้งาน (Pre-treatment) สามารถทำได้โดยทั้งทางกายภาพ ทางเคมีและทางชีวภาพ หรือใช้ร่วมกันขึ้นอยู่ชนิดชีวมวลและความเหมาะสมของสมบัติทางกายภาพและเคมีในชีวมวล โดยเครื่องจักรในกระบวนการผลิตจะประกอบด้วย 1) ถังหมักแบบกะ ขนาด 600 ลิตร มีระบบการให้ความร้อนและมีระบบควบคุมด้วยระบบ PID สามารถควบคุมอุณหภูมิและใบกวนตามเงื่อนไขที่ตั้งไว้ 2) ปั๊มชนิด เกียร์ปั๊มใช้ในการดึงของเหลวจากถังหมักผ่านถังกรอง 3) ถังกรองซึ่งจะมีชั้นกรองหยาบและละเอียดภายใต้ความดัน ไม่เกิน 3 bar 4) ชุดให้ความร้อนก่อนเข้ากระบวนการกลั่นพร้อมระบบควบคุมอุณหภูมิ 5) ถังกลั่นลำดับส่วนใช้ในการกลั่นเอทานอลออกจากน้ำ 6) เครื่องควบแน่นใช้ระบบเครื่องทำความเย็นมาประยุกต์ใช้ 7) ถังบรรจุ ซึ่งกระบวนการผลิตเอทานอลจากชีวมวลที่ออกแบบมี ปริมาตรการหมัก 480 ลิตร กำลังการผลิตเอทานอล 48 ลิตรต่อกะ ที่ปริมาณเอทานอลหลังการหมัก 10 เปอร์เซ็นต์