การตรวจสอบไวรัสัส Pineapple mealybug wilt-associated virus-1 และ -2 สาเหตุโรคเหี่ยว

[doa]

การตรวจสอบไวรัสัส Pineapple mealybug wilt-associated virus-1 และ -2 สาเหตุโรคเหี่ยวสับปะรดโดยเทคนิค multiplex PCR
วันเพ็ญ ศรีทองชัย, ปริเชษฐ์ ตั้งกาญจนภาสน์ และกาญจนา วาระวิชะนี
กลุ่มวิจัยโรคพืช สำนักวิจัยพัฒนาการอารักขาพืช

          การพัฒนาวิธีการตรวจสอบไวรัสสาเหตุโรคเหี่ยวสับปะรดทั้ง 2 strain (PMWaV-1 และ PMWaV-2) ในปฏิกิริยาเดียวกัน โดยอาศัยเทคนิค Multiplex RT-PCR เริ่มจากการออกแบบไพรเมอร์บริเวณ heat shock protein gene ที่มีความจำเพาะต่อไวรัส PMWaV-1 ได้แก่ PM1_HS_M_F : 5’ CCACTCTGTGTTTC TCTCCAGG 3’ และ M1_HS_M_R : 5’CTCCCAGATAGTTATCTCCCATCG 3’ และไพรเมอร์บริเวณ heat shock gene ที่มีความจำเพาะต่อไวรัส PMWaV-2 ได้แก่ PM2_HS_M_F : 5’ CAAGGACG GGTCGGTAATGCTAG 3’ และ PM2_HS_M_R : 5’ CCAACGCTAAA CAGTA CGCATACC 3’ จากนั้นการสกัดอาร์เอ็นเอของเชื้อ PMWaV-1 และ PMWaV-2 จากใบสับปะรดเป็นโรค โดยใช้ชุดสกัดสำเร็จรูป (MasterPureTMRNA Purification Kit ของบริษัท EPICENTRE) แล้วนำมาทดสอบและปรับระยะเวลารวมทั้งอุณหภูมิให้เหมาะสมในการสังเคราะห์เพิ่มปริมาณ cDNA โดยเทคนิค Multiplex RT-PCR พบว่า อุณหภูมิและเวลาที่เหมาะสม ได้แก่ เริ่มจาก 50 องศาเซลเซียส นาน 30 นาที เพื่อสังเคราะห์ cDNA จากนั้นเข้าสู่ปฏิกิริยา PCR เริ่มจาก 95 องศาเซลเซียส นาน 30 นาที (94 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที, 60 องศาเซลเซียส นาน 45 วินาที, 72 องศาเซลเซียส นาน 60 วินาที) รวม 35 รอบตามด้วย 72 องศาเซลเซียส นานอีก 10 นาที 25 องศาเซลเซียส นานอีก 15 นาที หลังจากนั้นนำ PCR product ที่ไดไปตรวจสอบขนาดของชิ้นดีเอ็นเอด้วยวิธี gel electrophoresis ใน 2% agarose ที่ 100 V. นาน 35-40 นาที พบว่าไวรัส PMWaV1 ให้แถบสีขาวขนาด 635 bp ส่วนไวรัส PMWaV2 ให้แถบสีขาวขนาด 380 bp